nature chemical biology | 从头设计用于塑造蛋白质功能的支撑环

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在蛋白质治疗领域，尽管抗体治疗保持主导地位，但非抗体结合蛋白因其在稳定性、结合亲和力、组织递送和制造方面的优势而受到重视。开发这些蛋白的方法主要有两种：随机文库选择和蛋白质设计。随机文库选择虽然能够识别出多种高亲和力的结合蛋白，但形状多样性受限。计算设计能够提供更多灵活性，但面临长环柔性和结构多样性的挑战，尤其在从头设计蛋白质功能位点时组织多个结构环非常困难。

鉴于目前的这些挑战，David Baker组于5月的nature chemical biology上介绍了一个设计蛋白质结构环的方法：设计串联重复的包含9至14个残基的结构环蛋白质，并通过氢键得到加固。实验结果表明，这些设计出的蛋白质具有单分散性、高溶解性、良好的折叠状态和热稳定性，且其晶体结构与设计模型高度一致，证明了环结构和支撑的设计的有效性。

设计方法

作者通过计算设计方法克服了长环从头设计的挑战，并针对锚蛋白支架在形状多样性方面的限制进行了改进。其中设计了一种新型的重复蛋白，其包含9至14个残基的结构环，并通过氢键和疏水相互作用形成了加固的环-环支撑网络。通过系统地采样和参数化生成骨架模型，确保了螺旋末端的距离适合长环的安装，排除了不利于环支撑的模型，并优化了骨架的位置控制。

利用从天然蛋白质中观察到的β转角和螺旋封盖相互作用，作者构建了β转角基序和螺旋封盖基序的文库，并在环采样过程中随机整合这些基序，以生成具有多个长环的完整重复蛋白模型。

图1a展示了作者的设计策略和过程：顶行显示了与长环相兼容的重复蛋白骨架的生成；第二行和第三行展示了多个长环在蛋白质支架上的构建；底行则展示了在骨架上设计序列，以进一步稳定环。图1b和1c分别展示了经过计算机验证的设计，这些设计具有不同的重复蛋白曲率和环几何形状，以及采用了多环支撑策略。

图1. RBL 的计算设计

实验表征

作者成功设计并表达了102种新型重复蛋白(RBL)，并使用金属亲和层析从大肠杆菌中纯化了它们。这些蛋白质中多数显示出良好的溶解性、单分散性和单体性，并通过SEC-MALS（图2b）和CD光谱（图2c）得到了验证。14种设计通过了SAXS验证（图2d），显示了与设计模型一致的散射曲线。

特别是，RBL4的晶体结构在1.8 Å分辨率下解析出来，展示了高度一致的设计模型和晶体结构（图3a-e）。晶体结构中精确重现了设计中的环支撑相互作用，如双齿环间氢键和环-螺旋盐桥（图3c-d）。

RBL7的设计虽然晶体衍射分辨率不高（4.2 Å），但通过引入二聚体界面，作者成功解析了RBL7_C2_3的晶体结构，分辨率达到3 Å，再次证明了设计的有效性（图3f-g）。晶体结构与设计模型的匹配度很高，进一步证实了设计中环支撑相互作用的准确性（图3h-j）。

图2. 设计的螺旋 RBL 的生物物理特性

肽结合 RBL 的设计

作者设计的RBL开辟了无需大规模筛选即可针对广泛靶标设计高亲和力结合蛋白的新途径。通过专注于具有重复序列基序的肽，能够设计出与这些肽特异性结合的RBL，并利用其重复单元与肽序列中的多个基序副本相结合。这一方法基于锚蛋白家族蛋白的结合特性，通过设计特定的肽序列结合剂，实现了与肽的高亲和力和特异性相互作用。

图3. 通过X射线晶体学的结构表征

作者利用计算设计开发了34种结合蛋白，专门针对六次重复的(DLP)6、(KLP)6和(DLS)6肽序列。在分裂荧光素酶测定中，7种设计显示了明显的结合信号，并通过荧光偏振测量确认了高亲和力和正交性（见图4）。

所选的结合剂基于RBL4，展现出高度一致的结合模式（图4a,d,g）。设计的结合剂与肽残基侧链特异性相互作用，X位置的Asp/Lys形成盐桥，Y位置的Leu参与疏水作用，而Pro/Ser与螺旋底部残基相互作用（图4b,e,h）。(DLP)6和(KLP)6结合剂显示出极高的亲和力，而对(DLS)6的结合较弱，指向了Pro在结合中的关键作用（图4c,f）。通过引入Gln介导的双齿氢键，优化了与(DLS)6的结合，达到了2.9nM的高亲和力，同时保持了对(DLP)6的结合能力（图4i）

图4. 设计的重复肽结合RBLs

作者提出的RBL设计为创造具有新功能的蛋白质提供了两条途径。第一种途径是通过随机文库生成结合酵母展示等技术，从RBL中开发出能结合特定靶标的结合物，与从锚蛋白重复蛋白开发的DARPin类似。第二种途径是通过计算设计方法，利用不同支架上的多样支撑环，定制能与多种靶标结合的蛋白质。晶体结构分析验证了计算设计的有效性，特别是通过设计密集的氢键和非极性相互作用网络来稳定蛋白质的环结构。

供稿 | 徐艺然

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲 雨萱

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